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品牌：百欧博伟生物
标签： KYC 55，BIOBW菌种查询
平台编号：bio-64041
规格：甘油
发货：3天内
北京百欧博伟生物技术有限公司拥有Biolog微生物鉴定系统，超低温冰箱，生物安全柜等仪器设备可进行对微生物分离、
鉴定等常规的分子实验研究。对我国生命科学研究、生物技术创新和产业发展的需求进行积极的面对社会乃至国外收集保
藏提供微生物菌种资源。在保证生物安全和保护知识产权的前提下，为工农业生产、卫生健康、环境保护、科研教育提供
微生物物种资源、基因资源、信息资源和专业技术服务。
1. 菌株
Agrobacterium tumefaciens KYC55(pJZ372)(pJZ384)(pJZ410) ，AHL 高效检
测菌株，Tc2uM/mL,Spe100,Gm100，28℃
2. 保存Preinduced cell（简称 pre）
2.1 接种KYC55至LB中活化，加入相应抗生素。
2.2 长出后，1%转接至ATmedium中，28℃培养，长至OD600约0.6左右。
2.3 10000rpm×10min 离心，去除上清。以“AT/甘油＝20”的量加入20％甘油
（即浓缩20倍），分装至1.5ml离心管中，-20℃保存。
3. 制备待检测菌上清
3.1 培养待测菌至OD6001.5左右，12000rpm×2min离心保存上清。多余上清或
暂时来不及做assay的上清可以保存在-20℃。
4．Bioassay
4.1 菌液培养
准备无菌空三角瓶，按每株待检测菌1.5ml（包括阴性和阳性对照）计算所
需ATmedium的量，加入其中。
加入千分之一KYC55Pre至三角瓶中，和AT混合均匀后，1.5ml每管分装
到无菌试管中。
标记试管，在每管中分别加入150ul待测上清液。同时用阳性菌株上清和培
养基分别作为阳性和阴性对照。28℃摇床培养过夜。
4.2 bioassay
培养至OD600 0.6左右时，取出进行生物显影。
在2ml离心管中，分别顺序加入：
0.8 ml Z-buffer
2 滴0.05% SDS
3 滴氯仿
0.2ml菌液
盖上盖子用力振荡后，再加入100ulONPG。再用力振荡，并开始计时。
观察菌液颜色，有明显变黄后，加入0.6ml1MNa2CO3终止反应，并记录时
间。若始终没有变黄，则2h后终止反应。将离心管离心12000rpm×2min，测
OD420。以试管中残留菌体测OD600。
5. 数据处理：
公式：MillerUnits = 1000*OD420 / [OD600*(Ts-To)*V 菌液
]
其中：Time以min为单位
Volumn 为反应时所加的菌液量（0.2ml）
附：
1. AT 培养基
20×ATsalts：(NH4)2SO4 40g；MgSO4 1.56g；FeSO4•7H2O 0.1g；MnSO4•
H2O
0.044g；以 dH2O 定容至1000ml；
20×ATbuffer：KH2PO4 214g；pH7.3；以dH2O定容至1000mL；
50%Glucose
各组分单独灭菌，50%Glucose过滤除菌或115℃灭菌。
配置AT培养基（1000mL）时，分别将50mL20×ATsalts、50mL20×AT
buffer、10 mL 50% Glucose 和 890 mL 无菌水在灭过菌的空试剂瓶中混合。
同时加入培养JZA1的抗生素，既免去后期培养的麻烦，也可以防止染菌。
2. Z-buffer
Na2HPO4.7H2O 16.1g；NaH2PO4.H2O 5.5g；KCl 0.75g；MgSO4.7H2O 0.245g；
β-巯基乙醇 2.7ml；
保存在4℃。
3. o-Nitrophenyl β-D-Galactopyranoside（ONPG）（Sigma 公司）
4mg/ml，分装后-20℃保存，只留一管放4℃使用
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